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蛋白质测定方法

来源：中国农业仪器网　类别：技术文章　更新时间：2009-07-27　阅读次

蛋白质测定方法一般来说，有以下五种：凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）。

表 五种蛋白质测定方法的比较

方法

灵敏度

时间

原理

干扰物质

说明

凯氏定氮法

（Kjedahl法）

灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％

费时

8～10小时

将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）

用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法（Biuret法）

灵敏度低

1～20mg

中速

20~30分钟

多肽键＋碱性Cu²^＋®紫色络合物

硫酸铵；

Tris缓冲液；

某些氨基酸

用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

紫外吸收法

较为灵敏

50～100mg

快速

5～10分钟

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收

各种嘌吟和嘧啶；

各种核苷酸

用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正

Folin－酚试剂法（Lowry法）

灵敏度高

～5mg

慢速

40～60

分钟

双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原

硫酸铵；

Tris缓冲液；

甘氨酸；

各种硫醇

耗费时间长；操作要严格计时；

颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法(Bradford法)

灵敏度最高

1～5mg

快速

5～15分钟

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm

强碱性缓冲液；

TritonX-100;

SDS

最好的方法；

干扰物质少；

颜色稳定；

颜色深浅随不同蛋白质变化

从以上表格中可以得出，不同的方法有不同的特点和优势，如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来，最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高，无论是测定时间，灵敏度还是受干扰程度，都是比较占优势的。

下面，我们来重点介绍一下其中一种蛋白质测定方法--凯氏定氮法。

凯氏定氮法（Kjedahl法）

首先将浓硫酸倒入样品中，边倒边摇晃，以使浓硫酸与样品充分接触，然后加热试剂。如果你需要加快实验进度，可以加入CuSO4作催化剂，这样，实验的反应时间就会大大缩短。CH₂COOH和H₂SO₄反应生成氨气，然后氨气又与H₂SO₄发生作用，固定了氮元素。这时我们得到了(NH₄)₂SO₄的溶液，然后我们可以用NaOH去跟硫酸铵反应，通过计算NaOH的使用量，就可以计算出氮的含量。下面是整个定氮法中发生的化学反应。

CH₂COOH+ 3H₂SO₄= 2CO₂ + 3SO₂ +4H₂O +NH₃ (1)

2NH₃ + H₂SO₄= (NH₄)₂SO₄ (2)

(NH₄)₂SO₄+ 2NaOH =2H₂O +Na₂SO₄ + 2NH₃ (3)

当我们得到氮的含量以后，我们就可以通过一定的计算，最终算出蛋白质的含量。

凯氏定氮法常用于有机化合物中的氮含量的测定，是蛋白质含量测定的经典方法，虽然在测试过程中，试剂用量很大，但是，不可否认，它所适用的样品范围之广，测试结果之精确，都是公认的。

现在，随着科技的发展，我们已经研究出带消化炉的凯氏定氮仪，它把定氮过程中的前两步骤通过仪器完成，方便了整个过程的实施�？隙ǖ悄芄蛔远亩匝方邢缓笳袅�，智能化完成，节省了时间和精力，提高了工作效率。这种蛋白质测定方法具有有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。浙江托普仪器有限公司提供这种产品，24小时服务热线：0571-87515059。